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【论肿道麻】通过免疫调节肿瘤微环境改善头颈部肿瘤治疗

　　未来TME领域更深入探究和新技术方法的开发对发现头颈部肿瘤生物标志物乃至更有效的个体化治疗方案具有深远影响。

　　靶向免疫治疗提高了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的生存率，但只有不到20%的患者对这些治疗产生了持久的反应。因此，考虑到头颈部鳞状细胞癌肿瘤微环境（TME）的各种复杂因素的新的免疫疗法是非常必要的。

　　头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第六大常见癌症，主要发生在四个解剖部位的粘膜表面:口腔、鼻腔、咽部和喉部。在过去的十年中，HNSCC患者的生存率得到了某些特定的程度的改善，这可能与老年人群长期吸烟、饮酒率下降有一定关系；但由于年轻人群与人类瘤病毒（HPV）相关的口咽鳞状细胞癌（OPSCC）发生率增加，HNSCC发病率呈持续上升趋势。HPV阳性的口咽鳞状细胞癌（OPSCC）患者的预后比HPV阴性的HNSCC患者的预后好，与HPV阴性的HNSCC患者相比，OPSCC患者通常合并症更少且对化疗和放疗的反应更好，而后者因经常使用烟草和酒精往往合并其他生理损害。此外，HPV阳性OPSCC免疫浸润增加，这些肿瘤的整体微环境和细胞生态系统可能与那些HPV阴性的患者截然不同。除了 HPV 状态外，由于先前治疗和肿瘤微环境 (TME) 中肿瘤进展的潜在影响，考虑局部晚期与复发和/或转移 (R/M) 疾病也很重要。口腔HNSCC的治疗通常是手术切除，然后辅助放化疗。分子靶向药物，如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂西妥昔单抗，已经在局部晚期疾病中显示出一定的成功率。同时，两种靶向PD1的免疫检查点抑制剂(nivolumab和pembrolizumab)也被批准用于R/M型HNSCC的治疗。然而，尽管肿瘤内PD1和PDL1的表达水平提升了两到三倍，但只有15-20%的HNSCC患者对这些药物有持久的反应。HPV阳性和HPV阴性HNSCC之间有着非常明显的基因组差异，为了研究下一代免疫疗法，探索各种微环境驱动怎么样影响这些疾病病因的免疫和基质景观十分必要。随着HNSCC发病率的增加，对于局部晚期和R/M疾病的治疗方法的改进至关重要。

　　先前研究利用癌症基因组图谱(TCGA)揭示了HNSCC患者之间重要的微环境差异。具体来说，即TCGA中的HNSCC队列(97例HPV阳性患者和423例HPV阴性患者)包含了从HNSCC不一样的部位切除的肿瘤标本中收集的大量RNA测序数据。这些资源提高了研究者对这两个TME免疫基因组图景的理解，以及这些图景是如何由临床特征塑造的，包括HPV状态、肿瘤分期、突变负担及烟草和酒精的使用。一些报道利用基因集富集分析和无监督聚类，通过免疫特征来解卷和识别HNSCC患者的细胞类型:无免疫浸润、淋巴细胞(富集CD4+ T细胞，CD8+ T细胞、B细胞和浆细胞)以及髓系树突状细胞(DC)(富集中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、DC、T调节细胞(Treg)和嗜酸性粒细胞。仅根据免疫浸润对患者肿瘤进行分类越来越受限，这些患者的细胞邻域(即三级淋巴结构;TLS)评估也可为HNSCC患者中多种细胞类型的动态相互作用提供关键的见解(与HPV状态无关)。如成人肉瘤所示，在HNSCC肿瘤中添加TLS这一指标对于预测免疫治疗的反应可能有很重要的作用。此外，成熟TLS(即具有生发中心的TLS;GC)的存在与生存期增加相关，提示TLS是HNSCC中重要的预测因素。从各种细胞类型的总丰度来看，与HPV阴性HNSCC患者相比，HPV阳性HNSCC患者的B细胞、血浆细胞、TH 1CD4+ T细胞、TH 2 CD4+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和CD8+ T细胞较高。HPV阴性HNSCC患者的单核细胞、巨噬细胞、NK T细胞和中性粒细胞含量更高。单细胞RNA (scRNA)测序技术的发展彻底改变了HNSCC TME中所有细胞群的转录组分析(图1)。

　　1.功能性CD8+T细胞是HPV阳性和HPV阴性疾病强有力免疫反应的关键

　　CD8+ T细胞可以识别肿瘤细胞呈递的抗原，并通过释放促炎细胞因子和细胞溶解颗粒直接杀死肿瘤细胞（图2）。虽然CD8+ T细胞的总体丰度在 HPV 阴性 HNSCC 患者中明显降低，但CD8+ T细胞比例与 HPV 阳性肿瘤患者比例相当的患者往往具有相似的有利结果。癌症和慢性病毒感染中CD8+ T细胞反应的标志之一是T细胞功能障碍，有时被称为衰竭，这种细胞状态的特点是效应功能的分级丧失（产生IL-2、TNF和IFNγ）和免疫抑制性受体PD1、TIM3、LAG3、CTLA4和TIGIT的共同表达。使用scRNA测序的高维免疫分析研究显示，CD8+ TILs是抗原特异性群体中表型和功能多样的群体。虽然流动细胞仪研究表明，HPV阳性肿瘤中PD1+ CD8+ 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的概率增加，但在HPV阴性肿瘤CD8+ TPD1high TIL（表现为IFNγ产生受损）的概率更高。此外，CD8+TILs的PD1high 表达可预测HPV阳性患者对anti-PD1/PDL1治疗的反应，但对HPV阴性患者的预后价值有限。这一些数据强调了进一步探究HPV阳性和HPV阴性HNSCC中CD8+TIL状态的重要性。scRNA测序比较了CD8+TILs转录组谱的整体变化，揭示了HPV阳性和HPV阴性疾病的五种广泛细胞状态，包括循环、细胞毒性、功能障碍前、早期激活和晚期耗竭的T细胞。

　　使用scRNA测序的高维免疫分析研究表明，末分化的CD8+ T细胞来源于干样CD8+ T细胞。HPV特异性干型CD8+ T细胞在体外HPV多肽刺激和免疫检查点抑制下能有效增殖。这一发现可能意味着ICI对HPV特异性干样CD8+T细胞进行战略性重振将使HPV阳性HNSCC患者获益。干样CD8+ T细胞也存在于HPV阴性的HNSCC肿瘤中，并产生大量的TNF，但它们的抗原特异性尚未确定，因此就需要进一步探究非病毒性新抗原特异性CD8+T细胞是否以及怎么样影响两种TME的治疗反应。

　　CD4+ T细胞在抗原刺激和分泌不同细胞因子的作用下分化成不同的效应子类型，从而引起抗肿瘤免疫应答。TH1 CD4+ T细胞产生促炎细胞因子，特别是IFNγ和TNF，它们在TME中诱导主要组织相容性复合物（MHC）I类和II类的表达，增强其他免疫细胞对肿瘤抗原的识别，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。TH17细胞产生IL-17、IL-2、IL-8和TNF，在病原体保护中发挥及其重要的作用。TH17细胞的促肿瘤和抗肿瘤作用在小鼠和人类肿瘤中都有研究，但在人类肿瘤的研究中较为受限。在HPV阳性HNSCC患者中观察到的TH1 CD4+T细胞数量高于HPV阴性HNSCC患者。RNA测序分析表明，与 HPV阴性HNSCC相比，HPV阳性的HNSCC肿瘤CD4+ TILs增加了TH1标记TBX21（编码转录因子T-bet和调节IFNγ的产生)以及TH17标记RORA和RORC的RNA表达。此外，HPV16特异性CD4+ T细胞主要表达IFNγ和TNF，并与顺铂疗法协同控制肿瘤细胞生长，突出了它们对癌症治疗的重要性。TH17细胞也聚集在HNSCC患者的外周血和肿瘤引流淋巴结中，原发性HNSCC肿瘤表达TH17诱导细胞因子IL-6、IL-23和IL-1β。在功能上，TH17细胞能够抑制HNSCC肿瘤的生长，并减少HNSCC肿瘤细胞在体外产生血管生成蛋白。未来的研究应进一步评估TH17细胞在HPV阳性和HPV阴性HNSCC TME中的抗原特异性和功能，以确定其对患者预后的影响。

　　Treg 细胞是CD4+T细胞的一个子集，由转录因子Foxp3(叉头盒蛋白3)和CD25的表达定义，它们抑制免疫效应细胞并促进肿瘤进展。Treg 肿瘤细胞通过分泌IL-10、IL-35和TGFβ等抑制性细胞因子，上调抑制性受体，通过CD39和CD73阻断代谢，通过CD25高表达阻断IL-2的局部TME来发挥免疫抑制功能。Treg 细胞存在于HNSCC患者的外周血和肿瘤中。HPV阳性HNSCC患者的肿瘤内Treg 细胞频率高于HPV阴性HNSCC患者，但最近的scRNA测序分析表明，Treg 细胞在HPV阳性和HPV阴性HNSCC细胞具有相同的转录组谱。有趣的是，Treg 细胞表现出独特的转录细胞状态，其特征是丰富干扰素反应基因或TNF受体(TNFR)家族基因。干扰素反应基因与Treg细胞的早期激活相关，而TNFR基因，如GITR（也称为TNFRSF18）、4-1BB（也称为TNFRSF9）和OX40（也称为TNFRSF4）后来在分化中表达，这表明对Treg细胞效应器功能的相互控制。HNSCC中的Treg细胞上也描述了关键抑制受体，如CTLA4。CTLA4在HNSCC患者的肿瘤内Treg 细胞中表达很高，并且在西妥昔单抗治疗后进一步上调。此外，CTLA4+ Treg 在西妥昔单抗治疗期间会抑制NK细胞功能，可能是由于TGFβ的产生，而伊匹单抗治疗通过消耗Treg 细胞恢复NK细胞功能。HNSCC患者中其他的抑制受体现在也进行了更彻底的检查。三级淋巴结构中的B细胞增强了抗肿瘤体液免疫。B细胞存在几个不同的亚群，这些亚群具有不一样的功能，除包括抗体的产生外，还包括抗原呈递、TLS形成的起始、细胞因子的产生和直接细胞裂解。此外，研究之后发现，B细胞可以预测患者的生存率，TLS可以预测患者对ICI的治疗反应。因此，它们作为潜在免疫治疗靶点，值得进一步研究（图3）。

　　HNSCC TME 中的先天免疫细胞NK 细胞是先天免疫系统的高度可塑效应细胞，受激活和抑制表面受体复杂相互作用的调节，同时这些表面受体监测着MHC I类表达和应激诱导的配体对潜在靶细胞的影响。当比较HPV阳性和HPV阴性HNSCC病因时，与HPV阴性肿瘤和周围基质相比，NK细胞浸润在HPV阳性肿瘤床和周围基质中更为突出。NK细胞浸润升高与HPV阴性和HPV阳性 HNSCC患者的无进展生存期和总生存期增加相关（图4）。NK细胞在遏制HPV驱动的增生异常方面的重要性在一份病例报告中得到了强调，该患者的NK细胞室功能失调，因此表现出多次复发的HPV相关皮肤和粘膜发育不良。在异基因造血细胞移植后，患者的所有病灶均获得长期缓解，从而恢复了NK细胞毒性。考虑到NK细胞在TME中可能的效力，应尝试增加HNSCC TME中NK细胞的量。

　　抗原呈递细胞DC对于肿瘤抗原特异性免疫的启动和极化至关重要。通过在MHC I类和II 类分子的背景下呈递肿瘤抗原衍生肽，它们能分别有效地启动和极化幼稚 CD4+ 和 CD8+ T 细胞。成熟后，DC还可以有效募集NK细胞（通过CXCL8、CXCL10和CX3CL1释放）并激活它们（通过IL-12p70 分泌和细胞间通过跨膜TNF和反式呈递IL-15接触），这导致这两种细胞类型之间的相互串扰和激活。在HNSCC中，DC浸润与T细胞和NK细胞浸润增加、肿瘤播散率降低以及患者生存率提高直接相关。HPV状态对DC浸润和功能的影响尚不明确。

　　肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是浸润癌症的一种主要的免疫群体。在HNSCC中，肿瘤中巨噬细胞浸润较正常粘膜升高，与R/M疾病和患者预后不良相关。TAM浸润增加与HNSCC 中MCP1/CCL2和MIP3α/CCL20表达升高有关。使用scRNA测序、流式细胞术和多光谱成像发现，无论病因是什么，TAMs都被认为是HNSCC TME中PDL1的大多数来自。TAMs不仅能在细胞膜上表达顶配水平的PDL1，而且还能表达在空间上与HNSCC TME中的CD8+T细胞相关的PDL1+ 巨噬细胞，这对细胞-细胞相互作用至关重要。 虽没证据说明HNSCC中的MDSC浸润是由疾病病因驱动的，但一般在HNSCC中观察到MDSC的浸润程度普遍升高，且与较高的临床分期和病理分级相关。在黑色素瘤患者中，大量循环和肿瘤浸润的MDSCs与患者预后差和对免疫检查点封锁缺乏反应有关。随着免疫检查点封锁后瘤内MDSCs数量的增加，也可获得免疫检查点封锁耐药性。为此，2021年的一项研究报告显示，HNSCC患者富含CD155+pdl1+ MDSCs，且tigi-cd155轴的阻断有效地提高了HNSCC患者对PDL1阻断的反应率。

　　在设计新疗法时，考虑非免疫基质细胞的作用很重要，因为这些细胞可以影响免疫细胞的表型和功能，并控制 TME 的营养和结构支持（图5）。在这里，作者更关注于肿瘤基质细胞，这中间还包括成纤维细胞和间充质基质细胞，以及它们与 HNSCC TME 中的恶性细胞和免疫细胞的相互作用。

　　据报道，成纤维细胞（CAFs）在人类实体肿瘤中的表型差异很大，因此在功能上存在一定的差异。在HNSCC中，CAFs与肿瘤细胞之间的代谢关系可能是一个潜在的靶向轴，并加强当前的ICI治疗。然而，CAFs与免疫细胞之间的代谢关系尚未完全阐明。有必要注意一下的是，CAF表型和功能的异质性可能是患者特异性的，并可能为CAFs的治疗靶向提供障碍。

　　HNSCC肿瘤来源的间充质干细胞（MSC）也被证明能够最终靠IDO的产生抑制T细胞的增殖，其表型与正常骨髓来源的MSC相似的表型。同时，研究表明，HNSCC MSCs可能具有促肿瘤和抗肿瘤作用，其在TME中的功能值得进一步研究。

　　尽管阻断抗PD1 /PDL1通路已经彻底改变了肿瘤领域(包括R/M HNSCC)，但只有少数患者从这些药物中受益。由于尚未就HNSCC TME的完整目标作出努力，因此取得的成功有限。事实上，大多数免疫治疗方案都是以T细胞为中心的(ICIs，如抗CTLA4和抗PD1, HPV特异性疫苗，以及过继T细胞疗法)。我们已看到了一些针对HNSCC TME多样性的新例子(例如，西妥昔单抗治疗Treg 细胞和NK细胞靶向和瘤内注射增加骨髓细胞功能)，但目前仍缺乏独特的治疗方法。针对HPV的努力仍在进行中，能预见的是，未来的研究将致力于发现特异性的肿瘤标志物以及针对每个患者TME的特点个体化免疫及靶向疗法。为实现这一目标，重要的是新辅助治疗窗口试验，以更好地定义当前和新药物的作用机制，以及考虑HPV阳性和阴性疾病中已知差异的前瞻性生物标志物驱动的组合选择。

　　基于现状，在设计下一代免疫疗法时需要仔细考虑完整的HNSCC TME(图6)。这对非病毒新抗原特异性CD8+ T对HPV阳性和阴性肿瘤患者的治疗反应的进一步研究有重要影响。此外，下一代免疫疗法应考虑怎么通过局部肿瘤内CD4+ T细胞的分化增加CD8+ T细胞，以及通过抑制肿瘤Treg 细胞活性来释放CD8+ T细胞的功能。除T细胞外的其他细胞类型也可能大大增强HNSCC患者的抗肿瘤活性。HPV阳性和阴性的HNSCC肿瘤患者在大多数情况下要不同的B细胞靶向策略，但总的来说，这些策略应该专注于诱导TLS的形成和驱动抗原特异性的肿瘤内B细胞成熟。提高对HNSCC患者NK细胞亚群功能的认识，对于提高免疫功能，特别是增加NK细胞流入TME，改善与髓系细胞(如DCs和巨噬细胞)的空间相互作用是必要的。此外，无论是HPV阳性还是阴性TME，减少M2极化和MDSC相关免疫抑制均可减轻癌前免疫。一些新技术，如scRNA测序、多重空间成像和空间转录组学研究也对发现针对TME治疗的新靶点具备极其重大意义。其他技术，如免疫PET和临床前模型也将为实现以上目标提供技术上的支持。本综述介绍了两种独特的HNSCC TMEs (HPV阳性和HPV阴性)细胞生态系统，通过讨论目前的治疗方法和新的方法及技术应用，提出了除T细胞之外的多个治疗靶点；将免疫与非免疫治疗结合可能为HPV阳性和HPV阴性HNSCC肿瘤患者的治疗策略提供强有力的改善。未来TME领域更深入探究和新技术方法的开发对发现头颈部肿瘤生物标志物乃至更有效的个体化治疗方案具有深远影响。